EURORealTime: Direktnachweis von Infektionserregern mittels Real-Time-PCR (IVD)

Vervielfältigung und Nachweis der Erreger-DNA: Real-Time-Polymerasekettenreaktion

Real-Time-PCR Amplifikationskurven von Quantifizierungsstandards (10², 10³, 10⁴, 10⁵ Kopien) und einer Probe mit unbekannter Zahl an Erreger-Erbgutkopien (Abbildung oben). Mit Hilfe der Standards generierte Standardkurve zur Bestimmung der Erregerzahl in der Probe (Abbildung unten).
Real-Time-PCR Amplifikationskurven
  • Für Nachweise, die auf der RNA-Sequenz beruhen, wird zunächst die RNA mittels reverser Transkription in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Bei Nachweisen, die auf der DNA-Sequenz beruhen, ist dieser Schritt nicht erforderlich.
  • Die relevanten, charakteristischen Teilstücke der DNA/cDNA werden im nächsten Schritt mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) millionenfach vervielfältigt.
  • Hierbei legen zwei Starter-DNA-Moleküle (Primer) den Bereich fest, der kopiert werden soll. Wenn die Patientenprobe den passenden DNA-Abschnitt (Zielsequenz) enthält, können die Primer daran binden und es wird eine Kopie der Zielsequenz hergestellt.
  • Diese Reaktion wird mehrmals wiederholt, so dass die DNA-Region zwischen den Primern sehr stark (exponentiell) vervielfältigt wird
  • Während jedes PCR Zyklus binden zudem spezifische, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden an die Zielsequenz, die nur ein Fluoreszenzsignal erzeugen, wenn eine Vervielfältigung der DNA erfolgt ist.
  • Am Ende eines PCR-Zyklus wird die Fluoreszenzintensität gemessen, so dass die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit verfolgt werden kann. Wenn die Zielsequenzen in der Patientenprobe fehlen, können die Primer und Sonden nicht binden: Die DNA wird nicht vervielfältigt und es gibt keinen Anstieg des Fluoreszenzsignals (s. Abbildung oben links).
  • Durch das Mitführen von entsprechenden Quantifizierungsstandards erlaubt diese Methode auch eine Quantifizierung der DNA-Menge in der Ursprungsprobe (s. Abbildung oben rechts).
  • Des Weiteren können durch Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen verschiedene DNA-Sequenzen in einer Reaktion nachgewiesen werden.

Vorteile des EURORealTime-Systems

  • Spezifischer und hochsensitiver Direktnachweis von Erregern auch in frühen Infektionsphasen
  • Gesamter Nachweis in einem Reaktionsgefäß, auch für RNA-Viren
  • Gebrauchsfertige PCR-Komponenten
  • Komfortable Führung durch den gesamten Arbeitsablauf (EURORealTime-Analysis Software)
  • Einfache Quantifizierung der Erregerzahl im Probenmaterial möglich*
  • Fehlervermeidung mit Hilfe automatisch generierter Pipettierschemata (EURORealTime-Analysis Software)
  • Vollautomatische, standardisierte Auswertung, Befunderstellung und Dokumentation (EURORealTime-Analysis Software)
  • Vollständiger Prozess nach IVD-Richtlinie validiert und CE-gekennzeichnet
  • LIMS-Anbindung vorbereitet

*Nur zutreffend für quantitative Tests.